Fakultas Peternakan Universitas Mataram: 2013

TUGAS

PENGANTAR BIOTEKNOLOGI

ISOLASI PLASMID DNA BAKTERI (E. coli)

DAN PCR (Polymerase Chain Reacion)

Oleh :

KELOMPOK 1

1.	AHMAD HIJUL MUBIN	(B1D 212 013)
2.	ABDUL WARISIN	(B1D 012 004)
3.	AHMAD TURMUZI	(B1D 012 021)
4.	AHMAD REZA JATNIKA	(B1D 212 016)
5.	A. RAHMAN	(B1D 012 003)
6..	AHMAD FURQON IRYANTO	(B1D 012 012)
7.	AKBAR HARTANTYO	(B1D 012 022)
8.	AHMAD RIFA’I	(B1D 012 023)
9.	AFIEK FAHMI AYATULLAH	(B1D 012 008)
10.	AHMAD KELANA WIJAYA	(B1D 012 015)

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS MATARAM

MATARAM

2013

KATA PENGANTAR

Assalamualaikum W.W

Segala Puji bagi Allah, tuhan semesta alam yang telah memberikan kesempatan dalam menyelsaikan laporan praktikum pengantar bioteknologi dalam mengamati isolasi plasmid dan PCR (Polyerase Chain Reaction). Sehingga kita dapat mengetahui bagaimana prosedure isolasi dan cara PCR ketika kita ingin melakukan pengamatan mengenai hubungannya dengan DNA maupun yang berkaitan dengan DNA.

Dunia mikrobiologi dewasa ini merupakan bidang yang sangat urgensi menopang kemajuan zaman dimana pada saat ini bidang kedokteran, maupun sampai dunia peternakan terkena imbas dari kemajuannya. Dalam bidang peternakan sangat beragam sekali penggunaan bioteknologi seperti yang kita ketahui bersama sejak terciptanya si Dolly kembar siam merupakan menggemparnya dunia bioteknologi yang semakin banyak dikenal oleh orang secara luas.

Sebenarnya sejak zaman klasik bioteknologi sudah biasa digunakan dalam keseharian namun tidak membahas begitu dalam hanya sampai tingkat organisme. Tetapi pada bioteknologi modern saat ini sudah membahas kepada mikromolekul seperti materi genetik (DNA). Itu cukup mengabarkan kepada kita bahwa seharusnyalah kita harus memperdalam kajian dalam pengantar bioteknologi ini yang merupakan langkah awal dari permulaan untuk terjun dalam bidang biologi molekuler.

Mataram, 14 Desember 2013

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL.......................................................................................................... i

KATA PENGANTAR........................................................................................................ ii

DAFTAR ISI...................................................................................................................... iii

ACARA I ISOLASI PLASMID ( Bakteri E. coli )

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang................................................................................................... 1

1.2. Tujuan Dan Kegunaan........................................................................................ 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA....................................................................................... 3

BAB III MATERI DAN METODE

3.1. Materi Praktikum................................................................................................ 8

3.2. Metode Praktikum.............................................................................................. 8

3.2. Tempat dan Tanggal Praktikum.......................................................................... 9

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Praktikum................................................................................................... 10

4.2. Pembahasan......................................................................................................... 10

BAB V PENUTUP

5.1. Simpulan............................................................................................................. 15

5.2. Saran................................................................................................................... 15

ACARA II PCR (Polymerase Chain Reaction)

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang.................................................................................................... 16

1.2. Tujuan Dan Kegunaan........................................................................................ 18

BAB II TINJAUAN PUSTAKA....................................................................................... 19

BAB III MATERI DAN METODE

3.1. Materi Praktikum................................................................................................ 22

3.2. Metode Praktikum.............................................................................................. 22

3.3. Tempat dan Tanggal Praktikum.......................................................................... 22

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Praktikum................................................................................................... 24

4.2. Pembahasan......................................................................................................... 24

BAB V PENUTUP

5.1. Simpulan............................................................................................................. 28

5.2. Saran................................................................................................................... 28

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

ACARA I

ISOLASI PLASMID DNA

BAKTERI (Echercia Coli)

1. BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Rekayasa genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam merekayasa materi genetik untuk kepentingan manusia. Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golonganorganisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan. Rekayasa genetika sudah digunakan dalam berbagai bidang kehidupan yaitu bidangkedokteran dan farmasi, ilmu pangan, kedokteran hewan, pertanian (termasuk peternakan danperikanan), serta teknik lingkungan juga telah melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing. Rekayasa genetika sendiri merupakan teknikn untuk memodifikasi DNA(sebagai substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas pewarisan sifat)untuk menghasilkan produk-produk baru yang memiliki kombinas sifat yang diinginkan (Chang, 2009).

Teknik yang digunakan dalam merekayasa suatu DNA adalah DNA rekombinan. DNA rekombinan adalah penyambungan molekul DNA yang satu dengan molekul DNA yang lainnya. DNA rekombinan merupakan gabungan antara DNA vektor dan DNA asing yang merupakan gen target. Gen yang terdapat di dalam DNA asing dimasukkan dalam suatu DNA vektor atau biasa disebut DNA plasmid (Brown, 2010).

Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom dan bisa ditemukan pada sel hidup (Royston 1972). Di dalam satu sel, dapat ditemukan lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid tidak mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut (Royston 1972). Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali normal, DNA plasmid dapat dibuang (Royston, 1972).

Plasmid telah diproduksi secara komersil oleh sejumlah perusahaan untuk digunakan sebagai vektor kloning (Gregory & Funnell 2004). Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memiliki beberapa kriteria, yaitu berukuran kecil, relatif memiliki jumlah salinan yang tinggi (high copy number), memiliki gen penanda seleksi dan gen pelapor, serta memiliki situs pemotongan enzim restriksi untu memudahkan penyisipan DNA ke dalam vektor plasmid (Gregory & Funnell, 2004).

Keberadaan plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA rekombinan. Keberhasilan suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast. Pemurnian DNA plasmid dilakukan untuk menghilangkan berbagai pengotor-pengotor yang berasal dari bagian sel yaitu dinding sel dan beberapa protein (Sambrook et.al.. 2006). Pada praktikum ini DNA plasmid diisolasi dari bakteriEscherichia coli, sehingga dengan dilakukannya pengisolasian dan pemurnian DNA plasmid diharapkan dapat memaksimalkan hasil DNA rekombinan dan rekayasa genetik dapat tercapai.

1.2. Tujuan dan Kegunaan

1.2.1. Tujuan Praktikum

Dari rangkaian praktikum ini ada beberapa kegunaan diantaranya yaitu ;

1) Mahasiswa dapat mengetahui prosedure dalam melakukan isolasi plasmid DNA.

2) Mahasiswa dapat mengetahui hal yang harus dipersiapkan ketika melaksanakan kegiatan praktikum.

3) Mahasiswa bisa mendapat bekal dalam penelitian yang berkaitan dengan isolasi DNA yang berkelanjutan.

4) Dapat mengetahui dengan jelas mengenai isolasi DNA secara mendalam.

1.2.2. Kegunaan Praktikum

Dari tujuan diatas dapat kita tarik beberapa kegunaan yang bisa kita aplikasikan, yakni :

1) Mahasiswa bisa melakukan prosedure dalam penelitian yang kaitannya dengan isolasi DNA.

2) Mahasiswa bisa memperispakan apa yang harus dilengkapi ketika sedang melakukan penelitian.

3) Dalam jangka panjang mahasiswa menjadi bekal dalam proses yang berkelanjutan ketika akan melakukan penelitian yang berkaitan dengan isolasi DNA.

4) Mahasiswa bisa menguasai pengamatan mengena isolasi DNA secara mendalam.

2. BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994).

Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan

membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).

Spektrofotometer

Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti, 2006)

Elektroforesis

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA,

sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi.

Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda).

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Restriksi

Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong

DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen.

Enzim restriksi melindungi bakteri dari infeksi virus. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme. Jika bakteri E. coli yang tidak memiliki enzim restriksi diinfeksi virus, maka sebagian besar partikel virus mampu menyebabkan infeksi. Namun, jika bakteri E. coli memiliki enzim restriksi, kemungkinan infeksi virus akan menurun.

Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan, misalnya DNA-metil transferase (dnmt). Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali oleh enzim restriksi tidak akan terpotong.

Secara umum, enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada komposisi sub unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan perlu tidaknya kofaktor. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks, multisubunit, kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi pengenalan. Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel, tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang dikenalnya. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna.

Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan reaksi. Meskipun demikian, sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi variasi dalam sumber, jumlah dan kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA, deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna.

Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20°C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70°C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung.

Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA.

Pemetaan Plasmid

Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994), dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh tiap-tiap endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel, kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasil yang didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi.

3. BAB III

MATERI DAN METODE

3.1.Materi praktikum

3.1.1. Alat-alat praktikum

Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum yaitu :

1) Mikro pipet

2) Mesin vortex

3) Mesin sentrifugasi (sentrifius)

4) Tabung ependorf

5) Gloves (sarung tangan)

3.1.2. Bahan Praktikum

Adapun bahan - bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :

Larutan I	Larutan II	Larutan III
50 mM glucose	0.2 N NaOH (harus fresh)	5 M potassium acetate 60 ml
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)	1 % SDS	Acetic acid glacial 11.5 ml
10 mM EDTA (pH 8.0)		H2O 28.5 ml

3.2. Metode Praktikum

Adapun metode yang digunakan dalam praktikum isolasi plasmid DNA Bakteri E. coli yaitu antara lain :

1. Resusupensikan pellet dengan 100 µl larutan I dingin. Campur merata dengan menggunakan vortex,diulang selama 3x

2. Tambahkan 200µl larutan II.Campur dengan merata dengan cara membolak balik tabung dengan cepat beberapa kali (jangan menggunakan vortex!)

3. Tambahkan 150µl larutan III dingin.Vortex selama beberapa detik kemudian balikkan posisi tabung (inverted) selama 10 detik. Kembalikan tabung keposisi semula dan simpan dalam es selama 3-5 menit.

4. Lakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 5 menit pada suhu 4ºc ,setelah sentrifugasi ,ambil supernatan dan pindahkan ke tabung lain.

5. Tambahkan phenol:chloroform dengan perbandingan volume 1:1 dengan jumlah supernatant yang diperoleh ,misalkan volume supernatant yang diperoleh adalah 300 µl.

6. Campur dengan merata dengan menggunakan vortex kemudian kemudian lakukan sentrifugasi (12,000 rpm) selama 2 menit pada suhu 4ºc.

7. Setelah sentrifugasi, ambil supernatant dan pindahkan ke dalam tabung lain.

8. Tambahkan etanol (2x volume supernatant ) untuk memperesipitasikan DNA.Campur dengan vortex, kemudian biarkan pada suhu kamar selama 2 menit.

9. Lakukan sentrifugasi 12,000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºc.

10. Buang supernatant perlahan lahan ,balikkan tabung dan biarkan kering udara selama beberapa menit.

11. Bilas DNA pellet dengan ethanol 70% (dingin) kemudian sentrifugasi seperti cara no 9.

12. Buang supernatant, balikkan tabung dan biarkan kering udara selama 10 menit.

13. Resuspensi DNA dengan 25 µl buffer TE(Ph 8.0)

3.1.Tempat dan Tanggal Praktikum

3.1.1. Tempat Praktikum

Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.

3.1.2. Tanggal Praktikum
Adapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar Bioteknologi ini pada hari Selasa, 10 Desember 2013.

4. BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.Hasil Praktikum

4.1.1. Gambar hasil isolasi

Suppernatan

Pellet

Gambar 4.1. Hasil Isolasi Plasmid DNA

Dari gambar diata telah bisa kita lihat pada Gambar 4.1 ada dua bagian setelah kita melakukan isolasi Plasmid DNA yang terlihat disana ada bagian yang terlihat bening dimana disanalah tempat DNA yang kita butuhkan larut. Dan ada yang berwarna ptih berwarna kekuningan merupakan dinding sel yang telah terjadi perusakan dari larutah fenol:chloroform dan bisa terekstraksi DNA dari bakteri itu sendiri.

4.2. Pembahasan

Praktikum yang berjudul “Isolasi DNA Plasmid” ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid dari bakteri Escherchia coli. Bakteri yang digunakan untuk diambil plasmidnya adalah bakteri Escherchia coli dikarenakan:

1. Mudah didapatkan.

2. Menghasilkan keturunan yang banyak dalam waktu yang singkat.

3. Memiliki jumlah plasmid yang banyak.

Beberapa teknik dapat digunakan untuk merusak sel Escherchia coli, untuk melepaskan molekul DNA plasmid. Metode yang digunakan pada isolasi DNA plasmid ini adalah metode alkali lisis atau lisis basa. Lisis basa adalah perusakan sel pada pH tinggi dengan NaOH dan SDS (sodium Duodenyl Sulfat), diikuti dengan pelepasan dan denaturasi DNA genomik (gDNA), material dinding sel, dan kebanyakan protein seluler. Meskipun DNA plasmid super coil juga terpengaruh karena rusaknya ikatan hidrogen akibat promosi basa, jika pH dijaga di bawah 12,5 pasangan basa terjaga dari pemisahan sempurna untai komplementer. Basa-basa berperan sebagai nuclei untuk renaturasi sempurna molekul DNA plasmid selama tahap netralisasi.

Jika lisis sel dilakukan pada pH di atas 12,5, atau jika pH ekstrim dalam larutan, pasangan basa plasmid dapat lepas dan terjadi denaturasi, membentuk pDNA single stranded. Setelah tahap lisis, larutan dinetralisasi dengan kalium asetat, yang mengendapkan SDS bersama-sama dengan gDNA terdenaturasi dan debris seluler. Pengerjaan berbeda dapat menghilangkan material tidak larut ini, sedangkan mayoritas pDNA tinggal dalam supernatan. Selama manipulasi, harus dijaga supaya tidak terjadi pemutusan gDNA membentuk fragmen-fragmen kecil yang tidak akan membentuk agregat.

Langkah pertama yang dilakukan adalah mengambil 8 ml bakteri dalam kultur cair yang telah dipersiapkan dengan menggunakan mikropipet dan memasukkannya ke dalam tabung eppendorf 15 ml. Kemudian mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selam 10 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal menyebabkan komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang biasa disebut dengan pellet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih kecil akan berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan. Dalam hal ini, sel bakteri Escherchia coli akan berada pada pellet sehingga kita mengambil pelletnya dan membuang bagian supernatan. Setelah itu menambahkan larutan A yang berisi Tris-HCl dan EDTA untuk mensuspensi pelet sampai larut dengan cara divortex. Di sini penmabahan larutan A akan membuat berat molekul sel menjadi lebih besar sehingga nantinya akan terendap sebagai pellet setelah disentrifuge. EDTA dapat berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Selain itu Tris-HCl menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada pH nya.

Langkah selanjutnya adalah menambahkan 2 ml larutan B (NaOH dan SDS) ke dalam campuran pelet dan larutan A lalu dibolak-balik 4-6 kali. Penambahan larutan B ini bertujuan untuk melisiskan dinding sel bakteri di mana SDS berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan mendenaturasi protein serta NaOH untuk mendenaturasi DNA genomik (kromosomal) dan mulai menghidrolisis RNA. Sehingga DNA kromosomal akan kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi dan yang dapat diperoleh setelah proses ini kemungkinan besar adalah DNA plasmid.

Berikutnya kami menambahkan larutan C yang berisi kalium asetat sebanyak 2 ml. Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi serta pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Penambahan juga berfungsi untuk menetralkan pH sehingga DNA plasmid tidak rusak. Setelah itu disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm. Setelah penambahan larutan netralisasi ini dihindari penggunaaan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA kromosomal yang mungkin masih ada akan menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatan yang berisi DNA plasmid. Jadi, pada akhir tahap isolasi ini bagian yang diambil adalah supernatan yang mengandung DNA plasmid dan membuang pellet yang mengandung debris molekuler. Supernatan diambil sebanyak 4 ml kemudian didiamkan selam 1 malam.

Dari hasil percobaan, setelah ditambahkan larutan A, larutan B, dan larutan c ternyata hanya diperoleh sedikit pellet dan supernatant tampak keruh. Hal ini mungkin terjadi karena debris molekul tidak semuanya mengendap sebagai pellet namun masih tercampur dalam supernatan bersama plasmid sehingga supernatan tampak keruh. Tidak mengendapnya semua debris molekul mungkin disebabkan pada saat penambahan larutan A sebagai larutan suspensi, EDTA yang berfungsi sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA dan sebagai pengkhelat magnesium yang berperan dalam merusak stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil belum bereaksi secara optimal. Selain itu Tris-HCl yang berfungsi menjaga pH larutan sehingga DNA tetap terjaga pada pH nya juga belum bereaksi optimal. Akibatnya, Tidak semua debris molekul dapat terendapkan sesuai ukuran dan berat molekulnya dan mencemari supernatan sehingga tampak keruh. Hal ini dapat juga disebabkan oleh kurang berfungsinya larutan B dalam melisiskan dinding sel bakteri sehingga tidak semua dinding dan sitoplasma dapat dirusak. Atau mungkin pula ketika mengambil kultur bakteri atau ketika menambahkan larutan, baik larutan A maupun larutan B, tip menyentuh dinding tabung sehingga plasmid terkontaminasi zat-zat pengotor. Dapat pula saat pengambilan kutur bakteri, ketika pengambilan pellet ternyata supernatan juga ikut terambil sehingga menyebabkan setelah penambahan larutan A, larutan B, dan larutan C, pellet sedikit dan supernatant menjadi keruh.

Pada tahap presipitasi kami menambahkan ± 0,1 vol NaOAc dan ± 2,5 vol larutan ethanol 0,4 ml SodAc (Sodium Asetat) dan 10 ml larutan ethanol absolut dingin ke dalam 4 ml supernatan yang telah didiamkan selama 1 malam. Penambahan ethanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas. Ethanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Prinsip pengendapan dengan menggunakan ethanol absolut dingin yaitu : Saat penambahan garam yaitu Sod Asetat yang berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA, maka ion-ion seperti kation Na⁺ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion ⁺ (Na⁺) dan ^- (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. Sehingga penambahan pelarut organik seperti ethanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na⁺ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.

Setelah penambahan ini, maka supernatan di dalam kedua larutan tersebut dimasukkan ke dalam freezer selama kurang lebih 1 jam. Tahap akhir dari presipitasi adalah sentrifuge supernatan beserta campurannya dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit. Hasil yang diperoleh adalah pelet yang mengandung DNA plasmid dan supernatan yang mengandung larutan NaOAc dan ethanol absolut. Sehingga, yang diambil pada tahap ini adalah bagian pellet dan yang dibuang adalah bagian supernatan.

Saat tahap presipitasi dilakukan ternyata didapatkan endapan/gumpalan putih yang merupakan protein menurutb keterangan dosen pembimbing. Hal ini juga mungkin berkaitan dengan langkah sebelumnya, atau mungkin saat pengambilan supernatan setelah penambahan larutan A, larutan B, dzan larutan C, pellet ikut terambil sehingga didapatkan plasmid yang sangat tidak murni.

Tahap terakhir adalah tahap pembilasan DNA plasmid yang diperoleh dengan cara menambahkan 2 ml ethanol 70 % . Tujuannya yaitu untuk membersihkan sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh plasmid yang murni. Kemudian membuang etanol 70 % dan membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit. Setelah itu, menambahkan 50 mikrolit dH₂O pada DNA plasmid dengan menyedot dan menyemprotkan kembali sebanyak ± 6 kali dengan mikropipet tip warna kuning sampai bercampur. Langkah terakhir, memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.

Plasmid hasil isolasi kali ini sangat buruk karena terdapat gumpalan putih yang merupakan protein sehingga kesulitan saat pemindahan dari tabung konikel ke tabung eppendorf menggunakan tip warna kuning yang sangat kecil. Sehingga, pada praktiknya, pemindahan plasmid oleh praktikan kemudian digunakan tip warna biru yang diameternya lebih besar. Namun, murni atau tidaknya plasmid hasil isolasi belum dapat diketahui sebelum dilakukan proses lebih lanjut, melalui proses running.

5. BAB V

PENUTUP

5.1. Simpulan

Dari praktikum pengantar bioteknologi isolasi plasmid DNA bakteri E. coli ini antara lain yaitu :

1) Dari hasil praktikum ini kita bisa menghasilkan supernatan dimana supernatan itu ada DNA yang kita amati larut di dalamnya.

2) Dari proses ini memiliki tahap-tahap untuk melakukan isolasi yaitu kita harus menghancurkan dinding sel dengan fhenol:chloroform itu sendiri sehingga pada tabung effendorf terlihat ada pellet yang merupakan serpihan dinding sel bakteri tersebut sisa dari pendestruksian dinding sel bakteri itu sendiri.

3) Hasil dari isolasi ini merupakan awal dari prosedure dalam PCR, setelah kita melakukan isolasi maka hal terpenting lagi adalah melanjutkannya ke proses PCR sehingga tidak sia-sia apa yang kita isolasikan tersebut.

5.2. Saran

Dari praktikum ini ada beberapa hal yang perlu disampaikan bahwa sebaiknya Co. Assisten seharusnya lebih teliti dalam melakukan prosedure-prosedure sehingga praktikan bisa tahu cara kerja yang benar dan bisa mendapatkan hasil. Agar semua kegiatan yang kita lakukan dan kita amati dapat membuahkan hasil dan tidak sia-sia.

Diharapka kepada praktikan juga harus lebih memperhatikan ketika sedang menyampaikan materi praktikum dan dapat memahami dengan benar.

ACARA II

PCR (Polymerase Chain Reaction)

1. BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.

Isolasi plasmid dari bakteri E.coli biasanya disebut dengan istilah Miniprep, kependekan dari Mini-Preparation. Sesuai dengan istilahnya, pekerjaan ini tidak banyak memakan waktu dan tidak pula berat untuk dilakukan. Apalagi sekarang sudah ada Miniprep Kit, yang hanya butuh kurang dari 30 menit untuk miniprep. Namun kali ini kita coba yang Miniprep manual aja. Alasannya, memakai kit kadang-kadang bukan yang terbaik, dan miniprep manual merupakan teknik paling dasar dan murah.

Polymerase chain reaction ("reaksi [be]rantai polimerase", PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel.

PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup, proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen.

Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperatur 94-96 °C, yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 45-60 °C yang memungkinkan terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA. Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin disalin; primer menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau elongasi (elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.

Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik).

Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metodeelekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika.

Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan.

1.2.Tujuan dan Kegunaan

1.2.1. Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari praktikum yaitu :

1) Untuk mengetahui taknik dan cara melakukan PCR.

2) Untuk memperbanyak DNA yang diinginkan secara in vitro atau di luar sel.

3) Digunakan dalam penelitian biologi seperti mengamati penyakit keturunan, identifikasi sidik jari, kloning DNA dan untuk mengamati kekerabatan antar spesies secara molekuler.

1.2.2. Kegunaan Praktikum

Adapun manfaat dari praktikum yaitu :

1) Agar mahasiswa dapat mengetahui apa itu PCR. Baik dalam pembuatan gel.

2) Mengetahui alat-alat dan metode yang digunakan dalam PCR, maupun dalam mengetahui proses dalam melakukan PCR.

3) Agar mahasiswa mengetahui cara memperbanyak DNA dengan alat PCR.

2. BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan yang mengandung DNA-target untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Dua primer oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit daerah DNA yang akan direplikasi. PCR merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan ukuran tertentu secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu (Muladno 2002).

PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA cetakan, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase. PCR adalah suatu metode yang menggunakan komponen‐komponen replikasi DNA untuk mereplikasi suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam tabung reaksi. Beberapa komponen yang penting yang dalam reaksi PCR adalah DNA target, primer, enzim Taq polymerase, deoksinukleoside triphosphat (dNTP) dan larutan penyangga (buffer). Molekul DNA yang targetnya akan dilipatgandakan jumlahnya dapat berupa untai tunggal atau untai ganda. Jumlah yang digunakan dalam proses PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas hasil PCR, tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah cukup (Barnum 2005)

Struktur DNA prokariot berbeda denganstruktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug &Cummings, 1994). Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekuldengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akanberada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasidengan kecepatan yang bervariasi (Kimball, 1992).

Polymerase chain reaction merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel. PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam perbanyakan DNA pada proses replikasi. (Alberts, B et al 2002).

DNA berkualitas tinggi yang akan didapat dalam suatu ekstraksi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam penandaan sidik jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol (JOSE dan USHA, 2000). Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (SURZYCKI, 2000).

Ekstraksi DNA memiliki prinsip memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Alves 2001).

Polymerase Chain Reaction ( PCR) adalah proses penggandaan DNA secara in vitro dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target. Reaksi PCR dibantu oleh enzim polimerase dan oligonukleotida yang berperan sebagai primer dan terjadi dalam thermocycler. Primer terbagi dua yaitu primer forward ( primer yang berada sebelum target ) dan primer reverse (primer yang berada setelah target). Antar primer terdapat puluhan hingga ribuan nukleotida yang menandakan panjang target DNA. Selain enzim polimerase, dibutuhkan dNTPs yang terbagi dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP (nukleotida berbasis Sitosin) dan dTTP (nukleotida berbasis Timin) (Muladno 2002).

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Dwidjoseputro 1998).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro 1998).

3. BAB III

MATERI DAN METODE

3.1.Materi praktikum

3.1.1. Alat-alat dan Bahan Praktikum

Adapun alat-alat dan Bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu :

Alat – Alat	Bahan
Mesin PCR	Air steril (SW) : 45
Elektroforesis	10 x buffer TAQ : 10 µl
Transiluminator sinar UV	2,5 Mm dNTP mix : 10 µl
Mikrowave	10 µM primer foward : 10 µl
Sisir gel	10 µM primer reverse : 10 µl
Mikro pipet	Template : 10 µl
Tabung ependorf	Enzim : 10 µ
Gloves (sarung tangan)	Agarose
Parafilm	Biffer TAE
Timbangan analatik	EtBr ( Ethidium Bromide)
Morta
Sentrifuga
Incubator
Tabung Erlenmeyer
Gelas Ukur

3.2.Tempat dan Tanggal Praktikum

3.2.1. Tempat Praktikum

Adapun tempat praktikum Pengantar Bioteknologi dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Fakultas Peternakan Universitas Mataram.

3.1.2. Tanggal Praktikum
Adapun tanggal dilaksanakan praktikum Pengantar Bioteknologi ini pada hari Selasa, 10 Desember 2013.

3.3.Metode Praktikum
Adapun metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :

1) Mengambil air steril sebanyak 45 µl dan dimasukkan dalam tabung PCR

2) Menambahkan 10 x buffre TAQ dan dimasukkan dalam tabung PCR

3) Menambahkan 2,5 mM dNTP mix sebanyak 10 µl

4) Menambahkan 10 µM primer forward sebanyak 10 µl

5) Menambahkan 10 µM primer reverse sebanyak 10 µl

6) Menambahkan template 10 µl

7) Menambahkan enzim polimerase sebanyak 10 µl

8) Setelah itu di mix supaya homogen dan dimasukkan dalam mesin PCR yang sebelumnya sudah diatur programnya.

9) Hasul PCR tadi dimasukkan dalam elektroforesis

10) Menambahkan looding late supaya kelihatan, dan dimasukkan pada masing-masing lubang gel 1 – 4, tunggu selama 10 meniKemudian diamati di transimlator sinar UV.

4. BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Praktikum

Buram

Terang

Gambar 4.1. Hasil PCR diatas sinar UV

4.2.Pembahasan

Gambar di atas telah memperlihatkan kepada kita bahwasannya kenapa ada yang terlihat dan ada yang terlihat agak buram, itu dikarenakan bahwa menunjukan terdapat bayak materi DNA yang berada pada posisi tertentu sesuai dengan pasangan basanya atau disingkat dengan pb. Apabila cahaya yang terang berada pada skala yang kita inginkan mka proses PCR yang kita lakukan berhasil.

Optimasi PCR perlu dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal. Secara umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor seperti jenis polimerase DNA, suhu, konsentrasi, PCR bufer, dan waktu. Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR.

Dalam hal ini suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan elongasi primer. Suhu tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna. Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan elongasi primer. Denaturasi DNA templat umumnya dilakukan selama 30 – 90 detik, ini semua tergantung pada DNA templat yang digunakan.

Waktu denaturasi yang terlalu lama akan merusak templat DNA dan sekaligus dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA. Sedangkan waktu denaturasi yang terlalu pendek dapat menyebabkan proses denaturasi tidak sempurna. Penentuan waktu untuk proses annealing berkaitan dengan panjang primer. Untuk panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu annealing 60 detik, sedangkan untuk panjang primer 18 – 22 basa cukup dengan 30 detik. Pemilihan waktu elongasi primer tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Secara umum untuk mengamplifikasi setiap satu kilo basa DNA diperlukan waktu 30 – 60 detik (Handoyo & Ari 2001: 26-28).
Enzim DNA polymerase yang digunakan pada saat proses perbanyakan DNA berasal dari Thermus aquaticus. Hal tersebut disebabkan karena bakteri tersebut bersifat termostabil sehingga enzim tidak mudah terdenaturasi pada proses PCR yang berlangsung pada suhu tinggi (Agustian 2008: 10).

Cara membuat reaction mixture yang pertama harus dilakukan ialah mengetahui komposisi atau komponen yang diperlukan dalam membuat campuran serta menyiapkan alat dan bahan yang digunakan. Selanjutnya, dengan menggunakan mikropipet dan tips, dimasukkan 14 µl ddH2O steril kedalam tabung PCR. Lalu, dimasukkan larutan bufer sebanyak 4 µl. Setelah itu ditambahkan dengan dNTP sebanyak 0,4 µl. Kemudian dicampurkan dengan primer forward dan primer reverse masing – masing sebanyak 0,3 µl. Dimasukkan larutan enzim DNA polymerase sebanyak 1 µl. Total reaction mixture yaitu 20 µl, karena belum dimasukkan dengan sampel DNA template. Setelah dimasukkan dengan DNA template sebanyak 5 µl, total larutan reaction mixture menjadi 25 µl (Abinawanto dkk. 2011: 49).

Metode PCR menggunakan mesin Thermal cycler Perkin Elmer 9600 untuk memperbanyak DNA. Pada dasarnya mesin tersebut bekerja sesuai dengan prinsip mesin thermal cycler yaitu dapat menaikkan suhu pada saat denaturasi dan polimerisasi serta menurunkan suhu pada tahap annealing sesuai dengan urutan waktu yang ditentukan.

Pengaturan waktu dan suhu siklus PCR dilakukan melaui pemograman tertentu. Tombol-tombol yang terdapat dalam mesin mengindikasikan perintah tertentu. Tombol program tersebut meliputi HOLD, CYCL, AUTO, dan METH. CYCL mengandung thermal ramps dan hold segments untuk siklus PCR, biasanya berisi dua atau tiga setpoints. HOLD untuk memprogram siklus akhir. METH dapat menggabungkan antar siklus. Program AUTO memungkinkan untuk menaikkan atau menurunkan jumlah setpoints waktu dan suhu setiap siklus. Amplifikasi DNA menggunakan mesin Thermal cycler Perkin Elmer 9600 yang pertama ialah dengan memprogram CYCL lalu menentukan tiga setpoints yang terdiri dari tahap denaturasi, annealing, dan polimerisasi lalu tentukan jumlah siklus. Kemudian diatur program HOLD satu sampai tiga. Setelah itu, gabungkan siklus dengan menekan tombol METH. Terakhir tekan tombol run untuk menjalankan siklus secara keseluruhan (Labequip 2006: 1).

Kondisi siklus reaksi yang digunakan dalam praktikum bergantung pada setiap tahap yang meliputi denaturasi, annealing, dan polimerisasi. Pada tahap denaturasi diatur dengan suhu sebesar 94oC selama 30 detik. Denaturasi berfungsi untuk menguraikan untai ganda DNA menjadi untai tunggal. Tahap annealing (penempelan primer) berlangsung selama 30 detik pada suhu 55oC. Tahap elongasi atau polimerisasi DNA berlangsung pada suhu 72oC karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR. Polimerisasi terjadi selama 30 detik.

Hasil dari tugas membuat diagram atau gambar perbanyakan DNA hingga siklus ke-5 didapatkan total jumlah untai DNA sebanyak 32 buah. Hal tersebut sesuai dengan rumus 2n, (25 = 32). Diagram siklus PCR dimulai dari satu rantai DNA yang akan diperbanyak, kemudian DNA tersebut mengalami denaturasi pada suhu 95oC sehingga menjadi untai tunggal. Selanjutnya DNA untai tunggal tersebut mulai dipasangkan dengan basa komplementernya pada tahap annealing. Pada tahap tersebut terdapat dua jenis primer yang bekerja, yaitu primer reverse yang melakukan penempelan dari ujung 3’ ke 5’ serta primer forward yang melakukan penempelan dari ujung 5’ ke 3’. Tahap terakhir ialah polimerisasi atau elongasi, yaitu pemanjangan untai DNA sehingga membentuk untai ganda DNA yang baru. Pada siklus ke-1 dihasilkan dua untai ganda DNA yang baru. Tahapan siklus PCR untuk siklus ke-2 hingga siklus ke-5 pada prinsipnya sama dengan siklus ke-1. Perbedaannya hanya pada jumlah untai DNA yang dihasilkan. Tahap siklus ke-2 menghasilkan empat untai DNA, siklus ke-3 menghasilkan delapan untai DNA, siklus ke-4 menghasilkan 16 untai DNA, dan yang terakhir siklus ke-5 menghasilkan 32 untai DNA.

5. BAB V

PENUTUP

5.3. Simpulan

Dari praktikum pengantar bioteknologi PCR ini antara lain yaitu :

1) Dari hasil praktikum ini kita bisa mengamati hasil dari isolasi plasmid dalam proses PCR setelah kita mengamati pada sinar UV dan bisa mengetahui bp (Base pare) atau pb (Pasangan basa) dari DNA yang kita isolasi dan kita PCR kan.

2) Dari proses ini memiliki tahap yaitu setelah kita isolasi plasmidnya keudian kita lakuka PCR dan kita melakukan elektroforesis untuk bisa kemudian diamati pada UV sehingga bisa kita simpulkan hsilnya.

3) Ketelitian merupakan prosedur yang tepat sehingga bisa menghasilkan dari kegiatan PCR ini.

4) DNA memilki pasangan-pasangan basa yang meiliki muatan yang berbeda-beda sehingga dalam proses PCR ini bisa kita melihat DNA yang kita amati memiliki pb yang berbeda-beda.

5.4. Saran

Diharapka kepada praktikan juga harus lebih memperhatikan ketika sedang menyampaikan materi praktikum dan dapat memahami dengan benar.

DAFTAR PUSTAKA

Alves MJ Coelo .2001.Mithocondrial DNA Variation in the highly endangered cypinid fish anaecypris hispanica : Inportance for conversation. Nature. COM NEWS@ NATURE. COM NATUREJOBS ATURREVENTS ABOUT NPG H.

Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA : Thomson Brooks/Cole.

Bartfai R Egedi .2003. Genetic Analysis of Two Common Carp Broodcast by RAPD and Microsattelite Markes. Aquaculture. 219 (2003) (halaman : 157 -167).

Brodgen . 2000. Pathogenesis and Infections Deseases. Washington DC . (halaman : 286).

Campbell N.A. 2002. Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Giri-Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri. Bandung : KPP Bioteknologi Bandung.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation.

Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Bogor : IPB Press.

SURZYCKI, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.

Susanti Sri . 2003. Pengertian DNA dan Karateristiknya : Kamus Biologi . Jakarta : PT Gramedia Utama.

Syafaruddin. 2010. OPTIMASI TEKNIK ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA YANG EFISIEN DAN EFEKTIF PADA KEMIRI SUNAN (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw).

Peralatan Isolasi DNA

Vortex

Sentrifuge

Hasil Isolasi DNA terdapat prenatan dan Pellet

Mesin PCR

Skala pasangan Basa

Proses Pencampuran Bahan Saat isolasi DNA

Proses Sentrifugasi

Transluminator Sinar UV

Fakultas Peternakan Universitas Mataram

Tab

Tuesday, December 24, 2013

TUGAS PENGANTAR BIOTEKNOLOGI ISOLASI PLASMID DNA BAKTERI (E. coli) DAN PCR (Polymerase Chain Reacion)